8.4 冷凍方法ZGdIVF導航

（一）平衡冷凍法ZGdIVF導航

胚胎冷凍的先驅Mazur提出的這一概念，也就是我們俗稱的程序冷凍或慢速冷凍法。平衡冷凍法中，將胚胎放入含有一定濃度冷凍保護劑的冷凍液中處理后，慢速降溫（0.2～2.0℃/min)至一個較低的溫度（-80～-35℃)。在降溫過程中胚胎會繼續脫水。平衡冷凍法已經應用多年，技術成熟, 效果穩定，廣泛地應用于IVF中原核期到囊胚期胚胎的冷凍保存，目前的IVF臨床中，采用平衡冷凍技術來冷凍保存早期胚胎仍占主導地位。IVF有關的試劑公司能夠提供多種冷凍和復蘇試劑盒。ZGdIVF導航

平衡冷凍法也用于精子和卵母細胞的冷凍保存。ZGdIVF導航

多數平衡冷凍法的方案中均包含以下幾個關鍵步驟：ZGdIVF導航

1） 將胚胎放入含有滲透性冷凍保護劑的溶液中初步脫水，平衡；ZGdIVF導航

2） 然后將胚胎放入含有滲透性冷凍保護劑和非滲透性冷凍保護劑的溶液中進一步脫水；ZGdIVF導航

3） 采用一定的降溫程序，將胚胎及冷凍液體慢速降溫到-80℃左右使胚胎進一步脫水，此過程中脫水原理是細胞外的冰晶形成；ZGdIVF導航

4）為了促使細胞外冰晶形成，在降溫的適當時期要使用“植冰“的技術；ZGdIVF導航

5）降溫結束后將胚胎放入液氮中儲存；ZGdIVF導航

6）復溫時將胚胎快速升溫到生理溫度；ZGdIVF導航

7）復溫后應用含有非滲透性冷凍保護劑的復蘇液使胚胎逐步復水，去除細胞內的滲透性冷凍保護劑。ZGdIVF導航

(1)基本原理：在平衡冷凍法程序中的脫水階段，胚胎被放入含有一定濃度滲透性冷凍保護劑的冷凍液中。此時細胞外的滲透壓較高，細胞內的水透過細胞膜流向細胞外，雖然此時滲透性冷凍保護劑也可以從高濃度的細胞外進入細胞內，但由于水的滲透速度更快，因此在剛進入冷凍液的開始階段，隨著水滲出細胞外，細胞體積因脫水而出現明顯的皺縮。但隨著時間的推移，細胞外的滲透性冷凍保護劑也逐漸進入細胞內，使細胞體積停止收縮，轉而逐漸膨脹，直至恢復接近原來的大小。也就是出現細胞“先變小，后變大” 的現象，這一過程的長短與細胞的大小、細胞膜的通透性、冷凍保護劑的種類、溫度均有關。較高溫度下、較小的細胞、滲透性強的冷凍保護劑可以達到更快的平衡。ZGdIVF導航

隨后，通常將胚胎轉移至含非滲透性冷凍保護劑的冷凍液中進一步增加細胞外的滲透壓，使細胞持續脫水，體積進一步減少（圖8-2)。以利于在隨后的冷凍過程中，盡量減少冰晶的形成。ZGdIVF導航

ZGdIVF導航

平衡后的胚胎開始程序降溫，當溫度降到冷凍液的冰點以下時，需要進行植冰，誘導冰晶逐步形成，冰晶的形成，導致細胞外液體濃度增加，伴隨著胚胎的進一步脫水，直至溫度降到-80℃左右，進入液氮。ZGdIVF導航

(2)植冰：是指當冷凍溶液的溫度下降至其冰點以下的某個溫度時（通常為-7～-5℃)，采用人工的方法誘發冷凍液內（細胞外）冰晶形成的操作，以終止溶液在降溫中發生的過冷狀態。ZGdIVF導航

1)過冷狀態：在溫度下降的過程中，當溫度剛冷卻至冰點以下時，含水的溶液如果沒有合適的冰晶“種子”，則不發生在冰晶形成，也就是不結冰，這種現象就是過冷現象。有時溫度可以遠遠低于冰點，例如含有DMSO的磷酸鹽溶液的冰點是-3℃,但是如果將它緩慢降溫同時不誘導冰晶形成，那么在冰晶自發形成之前可以降溫至-21℃€而不結冰。過冷液體是不穩定的，只要在此液體中投入少許該物質的晶體，便可誘發結冰。而冰晶一旦形成，由于水形成冰晶是放熱的過程，結果會使細胞外的冰水混合物溫度上升，并且在繼續形成冰晶的過程中持續一段時間，這段時間被稱為“熱平臺”。ZGdIVF導航

過冷現象會對胚胎冷凍造成危害，原因包括溫度和冰晶形成兩方面。ZGdIVF導航

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