1.4 未成熟卵母細胞的體外成培養AJ2IVF導航

人類卵子在卵泡發育期（卵子的生長和成熟)需要獲得一系列為保證受精和早期胚胎發育所需要的能力。體外培養環境對于卵子IVM的影響非常大。雖然目前已有很多來自動物學研究的數據，但是卵子IVM 培養液的選擇依據依舊是來源于其他細胞種類。AJ2IVF導航

不同的能量和營養物質可以在很大程度上影響卵子的核成熟和胞質成熟。葡萄糖、丙酮酸鹽和乳酸鹽是體細胞和卵子能量代謝的主要底物。對于倉鼠和兔卵，谷氨酸也可以被作為能量代謝底物來促進體外的核成熟。卵子對于丙酮酸鹽的吸收利用需要依靠顆粒細胞來完成。顆粒細胞可以把葡萄糖或乳酸鹽轉變成卵子可以利用的丙酮酸鹽。丙酮酸鹽或丁酮二酸鹽可以支持小鼠裸卵減數分裂到ΜⅡ階段，但葡萄糖、乳酸鹽或者磷酸烯醇丙酮酸鹽并不能起到相同效果。研究證實，線粒體的氧化代謝比葡萄糖的無氧代謝對哺乳動物卵子的能量生產更加重要。顆粒細胞將葡萄糖轉變為卵子可以吸收的丙酮酸鹽，表明顆粒細胞對卵子成熟營養環境的重要影響。丙酮酸鈉可以在不加血清的成熟培養液中支持和促進牛裸卵的核成熟。然而，報道指出僅僅有丙酮酸鹽并不能有效地支持卵子的胞質成熟。盡管如此，糖酵解代謝的信號通路反映了在卵子成熟階段，存在著很多參與控制基因的表達、控制和堆積的機制。此外，報道指出，葡萄糖通過Embded-Meyerhof路徑的代謝在牛卵子成熟過程中是很重要的。目前，并沒有關于人類卵子的代謝途徑的直接信息。AJ2IVF導航

小鼠實驗表明，無論有沒有有絲分裂抑制素的出現，小鼠卵母細胞的IVM都會伴隨著卵子cAMP含量的降低。而葡萄糖會導致COCs中cAMP 含量的升高，同時伴隨著在添加次黃嘌呤培養液中GVBD的降低。丙酮酸鹽直接影響小鼠卵子的核成熟。雖然報道指出葡萄糖會對人類裸卵的IVM產生抑制作用 ，但是我們的實驗表明在成熟液中添加適量的葡萄糖對牛和人類卵子的核成熟及胞質成熟有益處。AJ2IVF導航

必需氨基酸和非必需氨基酸經常被添加到含有血清或不含血清的胚胎體外培養液里面。對于很多種類的動物的胚胎，在培養液里面添加氨基酸對胚胎的發育是有益處的。氨基酸除了蛋白合成的作用，也是非常重要的滲透物，細胞內的緩沖劑、重金屬的螯合劑和能量的來源、多種生理調整素 (physiological regulators)的起始物如一氧化氮和聚胺。報道還指出，添加有氨基酸的培養液對老鼠囊胚體外培養的葡萄糖代謝有所影響。雖然，有些報道指出，氨基酸可以支持兔卵、倉鼠卵、豬卵和牛卵的成熟，氨基酸的添加對于人卵IVM的必要性尚不完全清楚。來自我們實驗室的結果表明在培養液中添加必需氨基酸對牛卵胞質成熟和支持進一步的胚胎發育是必需的。而且，非必需氨基酸和必需氨基酸對于卵子的胞質成熟起到了相輔相成的作用。AJ2IVF導航

據報道，在胚胎培養液里面加入水溶性維生素，特別是纖維醇，可以提高兔和倉鼠囊胚的孵化率 。維生素會影響小鼠卵和羊卵的葡萄糖代謝。然而，關于培養液中維生素的添加對未成熟卵子的成熟和發育的影響方面的信息還很有限。牛的胚胎發育研究指出，在卵子成熟培養液中添加維生素對牛的胚胎發育很重要。根據動物實驗，我們設計了一種新的IVM培養液，而且證實了這種IVM培養液對于從刺激或者未刺激周期取得的未成熟人卵的核成熟與胞質成熟都有益處。AJ2IVF導航

在復合的培養中液添加多種血清、促性腺激素(FSH或LH)、雌二醇在臨床中已廣泛用于人類卵母細胞IVM的研究。IVM研究已經證實了在培養液中加入生長激素會誘導COC減數分裂的恢復。此外，在IVM培養液中添加胰島素可以刺激小鼠和牛未成熟卵母細胞的成熟和受精后囊胚的形態發育。AJ2IVF導航

未成熟的COC被培養在IVM培養液中，要經歷24～48小時的IVM過程。經過24小時的培養，所有的COC會被脫去顆粒細胞來識別成熟程度。COC會被暴露在可以購買到的透明質酸酶中1分鐘，然后用精細的玻璃管來脫掉顆粒細胞。成熟的卵子隨后用IVF或者ICS1的方法授精。剩下的未成熟卵子（GV或ΜⅡ)將被繼續培養24小時。在取卵后48小時（IVM培養），余下的裸卵將再次被檢驗，其中成熟的卵子將立即通過IVF或者ICSI方法受精。 AJ2IVF導航