1.3 培養環境r61IVF導航

1.3.1 pHr61IVF導航

（一）細胞內pH（pHi）r61IVF導航

培養環境的pHe對培養液中生物體的影響不同。如原牛動物細胞就對培養液的pH變化不甚敏感，在pHe為5.75～7.4的培養液中可以維持7.15的pHi。為了觀察人卵母細胞對pHe的調節能力，Dale等通過在胞質內注射pH指示劑二羧羧基熒光素（bis-carboxyethylcarboxyfluorescein，BCECF）時發現，人卵母細胞在不同階段的pHi均為7.4。這一水平被認為是生理pH，而且，將卵母細胞罝于pH 8.0、7.5和7.0的培養液中時，其胞質內pH也隨著pHe發生相應的變化。在pH 8.0和7.5培養液中的卵母細胞經過一段時間重新獲得pHi 7.4水平時，pHe 7.0中的卵母細胞卻一直保持了pHi 7.0水平。這一觀察說明，人卵母細胞pHi隨著pHe發生變化而且其對pH環境變化的能力有限，特別是對酸性環境無應對能力。繼而在2000年，Philips等做了一個被很多人認為是經典的研究，他們將人2～8細胞卵裂期胚胎在含有沖pH熒光指示劑SNARF-1-AM的培養液中平衡后觀察到，其胞質內的平均為pHi 7.12 ± 0.008（n=199），不同階段差異甚小。而且卵裂期胚胎對堿性環境的調節能力依賴于培養液中C1^-的存在，說明細胞膜中存在HCO₃^-/ C1^-離子交換系統，而這個研究最值得注重的事實是這個交換系統啟動的閾值為7.2～7.3，也就是說，超過這個pHi時，細胞就會開始應對所謂的“堿性環境”了。而胚胎對酸性環境的調節則依賴于Na^-/H⁺和Na⁺/ HCO₃^- 系統，啟動閾值為6.8～6.9，可以調節pHi到7.1的水平?？傊?，人卵裂期胚胎可以通過以上途徑較準確地調整pHi使其保持在7.1～7.2的范圍。r61IVF導航

（二）培養液的pH（pHe）r61IVF導航

在培養過程中，一個令人困擾的問題是確定最佳靶pHe（target pHe）范圍，即細胞pHe是否應該和pHi完全一致，或是否應該略高于或略低于胚胎細胞的pHi 。目前，多數研究者傾向于使用比胚胎細胞pHi略高的pH作為最佳靶州pHe 。因為細胞膜的負電位會吸引培養液中的進入細胞膜，但更主要的是胚胎細胞內的代謝產物會降低pHi從而影響胚胎的正常新陳代謝。但平衡后的最高pH最好不超過74，因此多數培養液的CO₂水平可以設置在6%～7%，使得pHe保持在7.3左右的水平。r61IVF導航

不同的培養液制造廠家所提供的培養液對CO₂濃度和pH標準有所不同。G1^TM （Vitrolife）在6% CO₂中平衡后的pH標準為7.20～7.34 ，Quinn’s Advantage® Cleavage Medium ^TM（ COOK ）在6% CO₂中平衡后為7.3～7.5（或7.25～7.54），EmbryoAssist^TM（Origio）為7.2～7.3（或7.15～7.34）等（數據于2011-04-26取自各廠家網站的相關產品信息）。用于卵裂胚培養的產品pH標準間的這種差異代表了產品組分、制造過程和終端產品質量控制的嚴格程度。對一個生殖中心而言，檢測pH的目的不僅是為了檢查培養液的質量以確認pHe是否符合制造廠家所設定的標準，更重要的是了解并調整pHe使胚胎在最適合的pHe環境中正常發育。r61IVF導航

（三）pH測試r61IVF導航

觀察和測定pH的方法有多種。當培養液中含有酚紅時，其顏色的改變可以指示培養液pH變化， 因此，可以采用目測法觀察pH的變化。但是，觀察一個試管中的培養液pH變化時，其最大敏感度只能達到0.2 pH單位。因此，根據目測法常會影響pH正常判斷。r61IVF導航

　　近年來，考慮到酚紅為非生理性物質和對酚紅的雌激素樣結構的質疑等，很多培養液已不采用酚紅作為培養液添加劑。r61IVF導航

　　用常規pH測定儀測定pH比較經濟，如果嚴格遵循正確的測試方法，可以相對準確地獲得培養液或液滴中的pH。使用pH測定儀時需要注意如下問題：r61IVF導航

  （1）應選用精密度較高的pH測定儀。r61IVF導航

　 （2）pH電極在測試標淮緩沖液時要符合標準電壓要求。r61IVF導航

　 （3）盡量使用一次性pH標準液，采用標準液7.00 和10.00作校正，用標準液8.00確認校正結果。r61IVF導航

  （4）應該在37℃條件下測試，如果在室溫下測試，所得pH會有較大的差異。r61IVF導航

  （5）被測試培養液的預平衡時間和條件應該正確和充分。 r61IVF導航

  （6）測試應該按爭取的標準操作程序進行。r61IVF導航

關于pH測試方法，見附錄一。r61IVF導航

與pH測定儀相比，血氣分析儀（如Viasala）更適合測定培養液，特別是微滴的pH變化。這一方法簡單、準確和可靠，但有價格較高的缺點。 r61IVF導航

  （四）培養液pH的維持 r61IVF導航

  為了維持碳酸鹽緩沖系統的pH穩定，需要考慮到如下幾點：第一，盡量縮短在培養箱外操作的時間；第二，用MOPS或HEPES緩沖系統做取卵和顯微操作等操作；第三，在可能的情況下，盡量使用培養油以減緩CO₂揮發；第四，選用嬰兒培養箱進行體外操作。

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